Molekulární diagnostika
Molekulární diagnostika infekčních onemocnění pomocí metody polymerázové řetězové reakce (PCR)
V posledních několika letech jsou do rutinní klinické praxe zaváděny molekulárně biologické metody. Jednou z nich je polymerázová řetězová reakce (PCR). Pomocí této metody lze na základě komplementarity bází obsažených v molekule nukleové kyseliny (NA) namnožit cílovou NA. Přítomnost cílové NA ve vyšetřovaném vzorku je dále prokazována různými postupy (elektroforéza s následnou vizualizací v UV světle, hybridizace se specifickými sondami NA s následnou imunoenzymatickou vizualizací či s využitím fluorescenčně značených sond v uspořádání Real-time PCR). Metoda se vyznačuje rychlostí průkazu, vysokou specifitou i citlivostí (téměř 100%). Ve srovnání s ostatními "klasickými" metodami zůstává problémem standardizace této moderní metody.
Klinické využití PCR diagnostiky v oblasti humánní medicíny je velmi široké. Má velký význam v typizaci HLA systému, stále častěji je využívána v diagnostice dědičných či onkologických onemocnění. Pomocí PCR je možné testovat funkci případně aktivitu genů pro produkci specifických molekul (např. geny pro produkci cytokinů).
V neposlední řadě metoda PCR umožňuje přímo detekovat široké spektrum infekčních agens. Tímto způsobem je možné stanovit NA původců virových, bakteriálních, houbových nebo parazitárních onemocnění. Využití přichází v úvahu především pro patogeny s obtížným nebo dlouhodobým kultivačním průkazem (především zástupci rodu Mycobacterium, původci pohlavních nákaz - Chlamydia, Neisseria, Treponema pallidum, původce Lymské choroby atd.). V porovnání s metodami stanovujícími protilátky, PCR detekuje infekci ještě před sérokonverzí nebo u pacientů s nedostatečnou tvorbou protilátek. Detekce patogenů metodou PCR je závislá na počtu organismů přítomných ve vyšetřovaném vzorku. Může být ovlivněna technologií odběru vzorku, stavem pacienta nebo stupněm infekce.
Naše pracoviště využívá metodiku PCR v diagnostice infekčních onemocnění.
Ve spolupráci s mikrobiologickým oddělením Centra imunologie a mikrobiologie ZÚ byl zaveden přímý průkaz Mycobacterium tuberculosis ve spůtu a bronchoalveolární laváži. Metoda není vhodná pro monitorování terapie, neboť detekuje i mrtvé organizmy.
Hodnocení: Pozitivita Real-time PCR reakce vyšetřovaného vzorku je vyjádřena kvalitativně.
Pozitivní /negativní.
Dávivý kašel je výlučně lidským onemocněním, z člověka na člověka je přenosný kapénkami infekčního aerosolu. I přes zavedené očkovaní se v České republice několik stovek případů pertuse ročně objeví. Vyšetření je schopné v jedné reakci odlišit agens Bordetella pertussis od Bordetella parapertussis, jejichž klinické projevy se však často liší jen v délce trvání obtíží.
Hodnocení: Pozitivita Real-time PCR reakce vyšetřovaného vzorku je vyjádřena jako pozitivita Bordetella pertussis a/nebo Bordetella parapertussis. Pozitvní pro Bordetella pertusis; pozitivní pro Bordetella parapertussis; pozitivní pro Bordetella pertussis a Bordetella parapertussis; negativní.
Legionelové infekce jsou rozšířeny celosvětově, mnohé probíhají bezpříznakově. Sérologické studie prokázaly, že značná část populace má vůči legionelám získanou imunitu. Vzhledem k všeobecnému rozšíření legionel jsme s nimi, jako s vodními saprofyty, zřejmě v častém kontaktu. Infekce vyvolané L. pneumophila, pokud jsou symptomatické, mohou nabývat dvou různých forem. Probíhají buď jako těžké pneumonie, zvané legionářská nemoc (s mortalitou u imunokompromitovaných osob přes 20%), nebo jako chřipce podobné onemocnění, označované jako pontiacká horečka.
Hodnocení: Pozitivita Real-time PCR reakce vyšetřovaného vzorku je vyjádřena kvalitativně. Pozitivní /negativní.
Metodou PCR dále detekujeme původce Lymeské borreliózy - bakterii Borrelia burgdorferi sensu lato (zahrnující několik tzv. genomospecies včetně nejčastějších etiologických agens borreliózy v České republice tedy Borrelia garinii, Borrelia afzelii a Borrelia burgdorferi sensu stricto). Jednou z vlastností rodu Borrelia je dlouhodobá perzistence v organizmu, díky schopnosti měnit své povrchové antigeny, a tím unikání protilátkové odpovědi. Přímý průkaz se tak v některých případech stává jediným dokladem prokazatelné vazby mezi klinickými příznaky a borreliovou etiologií obtíží.
Hodnocení: Pozitivita Real-time PCR reakce vyšetřovaného vzorku je vyjádřena kvalitativně. Pozitivní /negativní.
Listerióza je onemocnění, které může probíhat bezpříznakově, u oslabených osob (novorozenci, poruchy imunity, AIDS) však může mít závažné následky, rizikovou skupinou jsou rovněž těhotné ženy. Jedněmi z nejzávažnějších jsou infekce novorozenců, ať už se jedná o infekce získané v děloze v podobě granulomatózní pneumonie někdy spojené se sepsí nebo o infekce získané během porodu či těsně po něm, zpravidla meningitidy a sepse. U dospělých osob se setkáváme, podle cesty přenosu, nejčastěji s respiračním onemocněním, případně s infekcí ran, sepsí, močovými infekcemi, někdy také meningitidou. Právě vzhledem k možnostem vzniku meningitidy či sepse u imunokompromitovaných jedinců byl do praxe zaveden přímý průkaz Listeria monocytogenes v likvoru a plné krvi.
Hodnocení: Pozitivita end-point PCR reakce vyšetřovaného vzorku je vyjádřena kvalitativně. Pozitivní /negativní.
Infekce způsobené C. trachomatis jsou celosvětově vůbec nejčastějším onemocněním přenášeným sexuálně, často se ale infekce projeví až jako přetrvávání obtíží po terapii kapavky – jedná se o tzv. postgonokokovou uretritidu. Chlamydiová infekce totiž bývá spjatá s jinými sexuálně přenosnými infekcemi a uvažuje se o ní dokonce i jako o „podpůrném momentu“ pro přenos HIV. Vzhledem k obligátnímu intracelulárnímu parazitizmu těchto bakterií není možná jejich kultivace na běžných bakteriologických půdách, kultivace na tkáňových kulturách dosahuje o cca 20% nižší citlivosti v porovnání s metodou PCR.
Hodnocení: Pozitivita Real-time PCR reakce vyšetřovaného vzorku je vyjádřena kvalitativně. Pozitivní /negativní.
Metodu PCR dále využíváme pro přímý průkaz viru hepatitidy typu B a typu C. Tímto způsobem je možné prokázat infekci u imunokompromitovaných osob. Lze také sledovat změny virémie (výsledek je uváděn jako počet kopií genomu viru/ml vzorku u hepatitidy B a jako IU HCV/ml vzorku u hepatitidy C) u Ab-pozitivních chronických HBV/HCV pacientů léčených interferonem. Výsledky testů je nutné interpretovat vždy v souvislosti s klinickými a dalšími laboratorními nálezy.
Hodnocení HBV: Pozitivita Real-time PCR reakce vyšetřovaného vzorku je vyjádřena jako počet kopií DNA HBV/ml vzorku. Pozitivní (kvantitativně) /negativní.
Hodnocení HCV: Pozitivita Real-time PCR reakce vyšetřovaného vzorku je vyjádřena jako IU RNA HCV/ml vzorku. Pozitivní (kvantitativně) /negativní.
Metodou PCR rovněž stanovujeme přítomnost herpetických virů (Virus Herpes simplex I/II, Virus Epstein-Barrové, Cytomegalovirus , Lidský herpetický virus 6). Lidské herpetické viry jsou úzce spojeny s lidskou populací. U zdravých jedinců mohou celoživotně perzistovat bez zjevných klinických příznaků, avšak v případě jakéhokoliv oslabení imunitního systému organismu mohou představovat vážné zdravotní riziko, včetně možného postižení CNS. Proto je u těchto virů důležité v daném časovém období ne jenom pouhé zjištění přítomnosti daného viru, ale rovněž hodnota virové nálože ve vyšetřovaném vzorku, která je (mimo výsledku u HSV I/II) nedílnou součástí výsledku.
Hodnocení HSV: Pozitivita Real-time PCR reakce vyšetřovaného vzorku je vyjádřena kvalitativně.
Pozitivní /negativní.
Hodnocení EBV: Pozitivita Real-time PCR reakce vyšetřovaného vzorku je vyjádřena jako počet kopií DNA EBV/106 buněk. Pozitivní (kvantitativně) /negativní.
Hodnocení CMV: Pozitivita Real-time PCR reakce vyšetřovaného vzorku je vyjádřena jako počet kopií DNA CMV/ml vzorku. Pozitivní (kvantitativně) /negativní.
Hodnocení HHV6: Pozitivita Real-time PCR reakce vyšetřovaného vzorku je vyjádřena jako počet kopií DNA HHV6/106 buněk. Pozitivní (kvantitativně) /negativní.
Rod Enterovirus zahrnuje dle antigenní struktury a patogenity několik skupin virů – zejména se jedná o Polioviry, Coxsackieviry a Echoviry. Všechny výše zmiňované viry mají výrazný tropismus k CNS, mohou ale rovněž způsobovat velký počet klinicky různě se projevujících onemocnění (exanthémy, postižení svalů, respirační a střevní projevy).
Hodnocení: Pozitivita Real-time PCR reakce vyšetřovaného vzorku je vyjádřena kvalitativně.
Pozitivní /negativní.
